Abstract:

Tirozinaz Enzim Aktivitesi Üzerine Reaksiyon Parametre Etkilerinin UV Spektrofotometre ile Yerinde Analiz Edilmesi Birçok uygulama alanına sahip tirozinaz enziminin etkinliğini arttırmaya yönelik olarak bu çalışmada tirozinaz enzim aktivitesi üzerine etki eden karıştırma hızı, pH, sıcaklık ve substrat konsantrasyonu gibi reaksiyon parametreleri UV spektrofotometre ile yerinde analiz edilmiştir. Enzim aktivitesi enzimtik o-kuinon ürününün 390 nm de verdiği absorbans değerine bağlı olarak hesaplanmış ve kinetik parametreler (Vm ve Km) Michealis Menten model denklimi kullanılarak bulunmuştur. Yerinde analiz yöntemi ile tirozinaz enzim aktivitesinin nukleofilik ajan kullanımına gerek kalmadan doğru bir şekilde tespit edilebileceği reaksiyon ortamının reaksiyon öncesi ve sonrası tarama profillerinden ve enzimatik o-kuinon ürününün zamanla oluşum grafiğinden anlaşılmıştır. 300 dev/dk karıştırma hızının yeterli olduğu, daha yüksek karıştırma hızlarında aktivitenin değişmediği ve bu eğilimin tüm enzim konsantrasyonlarında aynı olduğu sonucuna varılmıştır. Enzim aktivitesinin maksimum olduğu pH değeri 7.4 olarak saptanmış ve asidik pH değerlerine nispeten bazik pH değerlerine gidildikçe enzimin aktif gruplarındaki yapısal değişimlerden dolayı aktivitede daha fazla bir azalma olduğu görülmüştür. Enzimin en aktif olduğu sıcaklık 50 ºC olarak tespit edilirken bu sıcaklıktan sonra enzim yapısı bozunduğundan aktivitede azalma gözlemlenmiştir. Deneysel veriler Michealis Menten model denklemi ile yüksek korelasyon (%99) göstermiştir.  Maksimum hız (Vm) ve Michealis sabiti (Km) sırası ile 1.046 µmol/dk ve 0.228 mM olarak hesaplanmıştır. Sonuç olarak tirozinaz enzim aktivitesi üzerine reaksiyon parametre etkilerinin UV spektrofotometre kullanılarak yerinde tayin edilmesi, enzim inhibisyon mekanizmasını temel alan ve fenolik bileşiklerin, tarım ilaç kalıntılarının, patojenlerin ve GDO tespiti için geliştirilen enzimatik biyosensörlerin etkinliklerinin arttırılmasına katkı sağlayacaktır. In-situ Analysis of Reaction Parameter Effects on Tyrosinase Enzyme Activity by UV Spectrophotometer In this study the effect of reaction parameters such as stirring speed, pH, temperature and substrat concentration on tyrosinase enzyme activity were analyzed in-situly by UV spectrophotometer with the aim of increasing the efficiency of tyrosinase enzyme activity having huge number of applıcation area. Enzyme activity was evaluated depending on absorbance of o-quinone at 390 nm and kinetic parameters (Vm and Km) were found by using the Michealis Menten model equation. The ability to accurate determination of tyrosinase enzyme activity without using nucleofilic reagent by in-situ methot was understood from scanning profiles of reaction medium before and after the reaction and diagram of enzimatically produced o-quinone with time. It is concluded that 300 RPM stirring speed is sufficient, no change in activity at higher stirring speed and this trend is the same for all enzyme concentrations. The maximum enzyme activity was detected at pH:7.4 and high decrease in enzyme activity was observed towords basic pH condition with respect to acidic ones due to structural change in enzyme active sites. While the temperature at which the enzyme most active is detected as 50 ºC, the decrease in enzyme acticity above that temperature was observed due to denaturation of enzyme structure. Experimental values shows high correlation (99 %) with Michealis Menten model equations. Maximum velocity (Vm) and Michealis constant (Km) were calculated as 1.046 µmol/min 0.228 mM. Consequently in-situ analysis of reaction parameter effects on tyrosinase enzyme activity by UV spectrophotometer will contribute to increase in the efficiency of enzymatic biosensor developed for determination of phenolic compounds, pesticides, patogens and GMO based on enzyme inhibition mechanism

Keywords: