Özet:

Lipaz aktivitesinin spektrofotometrik yöntemle ölçülmesinde p-nitrofenol esterleri tercih edilmektedir. Yöntem, bu substratlardan lipaz hidrolizi ile açık sarı renkli p-nitrofenol (pNP) oluşturulmasına dayanmaktadır. Bu çalışmada, lipaz aktivite ölçümünde kullanılan p-nitrofenil propiyonat (pNPP) substratının kararlılığına ve pNP ürününün ışık soğurmasına çevresel koşulların etkisi incelenmiştir. Bekletme sıcaklığı veya süresi arttıkça, daha fazla oranda pNPP’nin kendiliğinden parçalandığı görülmüştür. On günlük bir depolama sonunda, 4o C’ye kıyasla 20o C’de 10 katı oranında pNPP (0.512 mM) kendiliğinden parçalanmıştır. Birbirini takip edecek şekilde 30, 60 ve 95o C’lerde sırasıyla 90, 20 ve 5 dakika inkübasyon süreleri, dakikada 0.0014, 0.0154 ve 0.0456 absorbans artışlarına neden olmuştur. Öte yandan, oluşan pNP ürününün 400nm civarında göstereceği absorbans değeri pH 6-8 aralığında ortam pH’sına oldukça duyarlı iken; tampon kapasitesi arttıkça (0.1-1.0 M) pNP ürünün gösterdiği absorbans (404 veya 348 nm) doğrusal artarak en az 2 kat düzeyine çıkmıştır. Bu duyarlılıklar, substratın kendiliğinden hidrolizine neden olacak koşulların azaltılması, pH ve tampon kapasitesinin standardizasyonu ile minimize edilebilmektedir. Buna ilave olarak, enzim hariç tepkime karışımının tüm bileşenlerini içeren bir “paralel kontrol” eşliğinde denemelerin yürütülmesiyle küçük hata kaynaklarının çoğunlukla sınırlandırılabileceği tespit edilmiştir.

Anahtar Kelimeler: